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    本發明係關於在一細胞內表現一基因的方法。該方法包括於一細胞內導入一抑制miRNA路徑與抗病毒防禦路徑之任一或二者的試劑；以及一包含一核酸分子之桿狀病毒，且該核酸分子包括操作性連接至一啟動子之一基因；以及於該細胞中表現該基因。
    公开号:TW201317349A
    申请号:TW101127509
    申请日:2012-07-30
    公开日:2013-05-01
    发明作者:Yu-Chan Chao；Yueh-Lung Wu；Pei-Yin Wu；Chia-Hung Wang
    申请人:Academia Sinica；
    IPC主号:C12N7-00
    专利说明:
    在細胞內表現外源基因的方法
    本發明係關於一種表現外源基因的方法，尤其是關於一種利用桿狀病毒在哺乳動物與昆蟲細胞表現外源基因的方法。
    桿狀病毒(baculovirus)係一種昆蟲病毒；然而，桿狀病毒亦可作為在昆蟲細胞與哺乳動物細胞中基因表現之有效載體。在所有的桿狀病毒中，加州苜蓿夜蛾核多角體病毒(Autographa californica multicapsid nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)被研究最多。另外，由於可容易地製造大量的秋行軍蟲細胞，AcMNPV與秋行軍蟲(Spodoptera frugiperda)細胞共同構成一種對於許多外源蛋白質產物上廣泛使用的系統。家蠶核多角體病毒(Bombyx mori NPV,BmNPV)係另一廣泛使用的桿狀病毒基因表現系統，且可以很容易地用來表現家蠶幼蟲體內的外源基因。兩種桿狀病毒皆顯示進入不同脊椎動物細胞的能力，使桿狀病毒表現系統的用途更多。AcMNPV可感染不同種類的昆蟲，且在一些鱗翅類(lepidopteran)細胞系中複製。然而，該病毒並未在家蠶細胞與脊椎動物細胞中複製或形成多角體(polyhedra)。
    微小RNAs(microRNAs，簡稱miRNAs)係為小RNA分子(22個核苷酸)，於真核細胞中被發現，係經由干擾轉譯及/或後轉錄(post-transcription)以調節基因表現。Drosha主要會認出具有stem-loop的原始miRNA，進而將其切割成大約60~70個核苷酸前驅物(pre-miRNA)，請參考Lee et al.,Nature,525：415-419(2003)。miRNAs前驅物藉由轉運蛋白Exportin 5運送到細胞核外而進入細胞質。在細胞質中，miRNAs前驅物被Dicer切割成帶有22個鹼基的成熟miRNA。成熟miRNA是一個單股的片段，會進入核醣核蛋白複合體中，會與互補的基因結合，亦稱為RNA誘導沉默複合物(RNA-induced silencing complex)。此複合物誘導miRNA至標靶mRNA，使標靶mRNA之轉譯表現下降，請參考Bartel,Cell,116：281-297(2004)以及Bartel and Chen,Nature Reviews Genetics,5：396-400(2004)。
    抗病毒的先天免疫系統(Antiviral innate immunity system)為宿主細胞對病毒辨識及阻絕的第一線防禦。先天免疫系統利用大量的模式辨識受體(pattern-recognition receptors,PRRs)辨識微生物與病毒，而模式辨識受體包括類鐸受體(Toll-like receptors)、類RIG-I受體(RIG-I like receptors)、類NOD受體(NOD-like receptors)，以及細胞內DNA感應受體(cytosolic DNA sensing receptors)，可對不同的病毒分子之病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)進行辨識。辨識之後，這些模式辨識受體可活化不同的訊號路徑並引起免疫反應，製造出干擾素與細胞素阻止病毒基因表現或病毒複製，請參考Akiral et al.,Cell,124：783-801(2006)。
    本發明基於非可預期地發現抑制(knocking-down)昆蟲以及哺乳動物中的確切基因，可以增強這些細胞內桿狀病毒轉導之基因的表現，亦即提昇轉導效率。
    因此，本發明描述一種用於在一細胞內表現一基因之方法。該方法包括於一細胞內導入(i)一抑制miRNA路徑與抗病毒防禦路徑之任一或二者的試劑；及(ii)一包含一核酸分子之桿狀病毒，且該核酸分子包括操作性連接至一啟動子之一基因；以及表現該基因於該細胞內。
    本發明亦包括一種製造桿狀病毒的方法，包含：導入一桿狀病毒及一抑制miRNA路徑之試劑至一宿主細胞；以及複製該桿狀病毒於該宿主細胞內，藉此製造出該桿狀病毒的後代。
    該試劑可為一化合物，其能抑制與miRNA路徑或抗病毒防禦路徑之基因或蛋白質。例如該試劑可為一以miRNA路徑或抗病毒防禦路徑之基因為標靶的siRNA或shRNA。
    本發明一或多個實施例之詳細說明於後述之實施方式及圖式中。本發明其他的技術特徵、目的以及優點將於說明書、圖式以及申請專利範圍中顯現。
    在細胞中，不能預期到抑制參與miRNA路徑或宿主抗病毒防禦路徑之基因表現，可增進桿狀病毒轉導(transduced)基因的表現、轉導之效率以及產生之病毒後代。
    因此，本發明描述一種在一細胞中表現由桿狀病毒轉導(baculovirus-transduced)之基因的方法，係藉由導入一試劑至一細胞，該試劑抑制該細胞之內源性miRNA路徑及/或抗病毒防禦路徑，然後以帶有一基因之一桿狀病毒感染該細胞，該基因將表現於該細胞中。
    這裡所使用的miRNA路徑係為產生、處理及活化miRNA之路徑，以調節基因表現。該些路徑包括但不限於：原始miRNA之表現、原始miRNA形成miRNA前驅物之處理、從細胞核中運送到miRNA前驅物至細胞質、miRNA前驅物形成成熟miRNA之處理、以及把該成熟miRNA併入RNA誘導沉默複合物(RNA-induced silencing complexes)。抑制miRNA路徑之試劑包含標靶及抑制miRNA路徑上任一步驟或組成之功能。例如，該miRNA路徑可由一試劑抑制，該試劑阻斷該路徑中一蛋白質的表現或功能，例如Drosha、Dicer以及Exportin-5。
    該抗病毒防禦路徑係關於細胞對抗病毒感染之機制或連續反應。例如，該路徑可包含先天免疫系統。抑制抗病毒防禦路徑之試劑可包含標靶及抑制抗病毒防禦途徑中任何步驟或組成的功能之試劑。該試劑可為阻斷該路徑中一蛋白質之表現或功能，例如類鐸受體-2(Toll-like receptor-2)、類鐸受體-3(Toll-like receptor-3)、類鐸受體-4(Toll-like receptor-4)、類鐸受體-9(Toll-like receptor-9)、STAT1、STAT6、介白素7R(interleukin 7R)、或介白素1A(Interleukin 1A)、絲氨酸-蘇氨酸激酶受體激酶-1(receptor-interacting serine-threonine kinase 1)、絲氨酸-蘇氨酸激酶受體激酶-2(receptor-interacting serine-threonine kinase 2)、髓樣分化初級反應基因-88(myeloid differentiation primary response gene-88)、腫瘤壞死因子受體相關因子6(TNF receptor-associated factor 6)、TANK結合激酶1(TANK-binding kinase 1)、磷酸肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase)、第一型RNA聚合酶多肽D(RNA polymerase I polypeptide D)。
    可用於上述方法的試劑，包含用於抑制關於miRNA路徑或抗病毒防禦路徑之一標靶基因表現或活性的核酸分子。這些核酸分子包含反義核酸(antisense nucleic acids)、小抑制RNA(small inhibitory RNAs,siRNAs)、小簪型RNA(small hairpin RNAs,shRNA)、核酶(ribozymes)、以及其他修飾核酸之分子如PNAs。
    該核酸分子或架構包括每股含有16~30個核苷酸之dsRNA分子，例如每股有16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸之dsRNA分子，其中該些股之一股與mRNA之標靶區域大致上相同，例如至少80%相同(或是更多，例如85%、90%、95%或是100%)，例如具有3個、2個、1個或0個錯誤配對的核苷酸，而其他股與第一股完全相同或大致相同。該dsRNA分子可利用化學合成，或於體內或體外從DNA模板轉錄而來，例如shRNA。該dsRNA分子可利用本領域之通常知識設計而得。
    本方法所使用的該核酸分子可包括siRNA以及修飾過的siRNA衍生物，例如修飾siRNA以改變性質例如之藥物動力學，舉例來說，該性質可為增加其在體內的半衰期，例如交錯連結的siRNA。siRNA衍生物可包括具有二股互補核苷酸的siRNA，故該二股為交錯連結的。在一些實施例中，該siRNA衍生物可被配對至一生物素分子(例如一光解生物素)、一胜肽(例如一Tat peptide)、一奈米粒子、一擬肽類(peptidomimetic)、有機化合物(例如一染劑，如螢光染劑)、或樹枝狀聚合物(dendrimer)。該配對可利用本領域通常方法達成，例如利用Lambert et al.,Drug Deliv.Rev.：47(1),99-112(2001)；Fattal et al.,J.Control Release 53(1-3)：137-43(1998)；Schwab et al.,Ann.Oncol.5 Suppl.4：55-8(1994)；以及Godard et al.,Eur.J.Biochem.232(2)：404-10(1995)之方法。
    合成的siRNA可利用本領域之通常知識送入細胞中，例如利用陽離子脂質體轉染(cationic liposome transfection)以及電擊轉染(electroporation)。siRNA及shRNA亦可在細胞內重組的DNA表現。
    一「反義(antisense)」核酸可包含一核苷酸序列，係與一「正義(sense)」核酸互補以編碼一蛋白質，例如與一雙股cDNA分子編碼股互補。該反義核酸可與標靶序列整個編碼股互補，或是僅與部分編碼股互補。在另一個實施例中，該反義核酸分子為對一編碼該標靶基因之核酸序列編碼股的一「非編碼區域」反義(例如該5’與3’未轉譯區域)。
    反義核酸可以利用本領域所知的化學合成或酵素性接合反應(enzymatic ligation reactions)方式建構。舉例來說，一反義核酸(例如一反義寡核苷酸)可用自然產生的核苷酸化學合成，或設計不同修飾的核苷酸以增加該分子的生物穩定性，或增加正義與反義核酸之間形成雙股的物理穩定性，例如，硫代磷酸(phosphorothioate)衍生物與啶(acridine)取代核苷酸皆可利用。該反義核酸亦以生物製造，係利用已在一反義方向次選殖(subclone)至一表現載體之一核酸(也就是說，RNA從插入的核酸將以反義方向轉錄至有興趣的標靶核酸)。基於標靶基因之序列，本領域具有通常知識者可容易地選擇並合成任何合適數量的反義核酸分子，以用於本發明之用途。
    標靶基因表現亦可被抑制，係經由將核酸序列互補至標靶基因(例如啟動子及/或增強子)調控區作為標靶，以形成標靶細胞中基因防止轉錄之三螺旋結構。請參考一般文獻：Helene,C.Anticancer Drug Des.6：569-84(1991)；Helene,C.Ann.N.Y.Acad.Sci.660：27-36(1992)；以及Maher,Bioassays 14：807-15(1992)。該作為三螺旋結構之標靶的可能性序列，可經由產生一稱作「之字形(switchback)」核酸分子而增加。之字形分子由交替5’~3’與3’~5’的方式合成，因此先製造出其雙股之第一股的鹼基對，接下來是另一股，排除嘌呤(purines)或嘧啶(pyrimidine)延伸的需要而呈現於雙股中的一股上。
    核糖酶(ribozymes)可用於進行酵素性切割，及以專一性、序列依賴的方式使其他RNA標靶失活。核糖酶經由把標靶RNA切割，而能抑制轉譯，可防止標靶基因的表現。核酶可利用本領域所知方法於實驗室化學合成，並修飾其結構以增加其穩定性以及催化活性。核糖酶基因可選擇性地經由本領域所知的基因傳送機制導入細胞。對一標靶核酸具有專一性的核糖酶，可包括一或多個標靶cDNA之互補核苷酸序列，且一序列對mRNA切割具有已知的催化序列反應(參考U.S.Pat.No.5,093,246或Haselhoff and Gerlach Nature 334：585-591(1988))。舉例來說，一四膜蟲L-19 IVS RNA(Tetrahymena L-19 IVS RNA)之一衍生物可於與標靶mRNA被切割核酸序列互補的核酸序列之活化區域建構，參考例如Cech et al.U.S.Pat.No.4,987,071；以及Cech et al.U.S.Pat.No.5,116,742。一標靶mRNA可用於自一RNA分子庫中選出具有專一性核糖核酸酶(ribonuclease)的催化性RNA，參考例如Bartel,D.and Szostak,J.W.Science 261：1411-1418(1993)。
    這裡提供的方法可應用於任何桿狀病毒感染或進入之細胞，例如昆蟲細胞與哺乳動物細胞。
    後述實施例僅為例示，並非侷限於其他任何方式的揭露。如果沒有進一步的說明，係被認為本領域具有通常知識者可基於此處的描述，利用本發明至最大限度。此處列舉的所有文獻皆完整地納入參考。 實施例
    小干擾RNA(Small interfering RNAs,siRNAs)係用來對準(target)昆蟲與哺乳動物細胞內不同基因，以評估經由桿狀病毒，將基因轉殖入細胞的效果。數據顯示阻斷(knocking-down)特定基因可以增加桿狀病毒外源基因的表現。這些特定基因包括昆蟲與哺乳動物細胞中的drosha與dicer，以及哺乳動物中的tlr2、tlr3、tlr4、tlr9、ripk1、ripk2、myd88、stat1/6、il-1a/7r、trdf6、tbk1、PIK3CG、以及polr1D。
    先前研究發現在將drosha或dicer之表現沉默(silence)的情況下，自桿狀病毒送入至哺乳動物細胞的基因表現會提高。此結果顯示內源性RNAi路徑會妨礙桿狀病毒作為一有效基因傳送載體至哺乳動物細胞之能力。
    在家蠶細胞BmN、哺乳動物骨肉瘤上皮細胞U-2OS以及非洲綠猴上皮細胞VeroE6內，siRNA分別成功地使內源性drosha及dicer的表現沉默。如第一圖(A)~(C)。所使用siRNA的序列如下表一所示。這些RNAi對被轉染的細胞未有顯著的細胞毒性，如第二圖。
    在一人類巨細胞病毒早期啟動子(human cytomegalovirus immediate early promoter，CMVie啟動子)的調控下，將含有綠色螢光基因之重組桿狀病毒轉染至drosha或dicer被沉默(silence)的U-2OS與VeroE6細胞。與轉染控制組siRNA，故與drosha及dicer皆正常表現的U-2OS細胞相較，螢光顯微影像顯示在drosha或dicer基因被沉默(silence)的U-2OS細胞中綠色螢光蛋白表現上升，如第三圖(A)。進一步由西方墨點分析U-2OS與VeroE6細胞確認這個發現，如第三圖(B)。
    為將數據量化，U-2OS及VeroE6細胞先分別轉染siRNA，轉染好的細胞接著在人類巨細胞病毒早期啟動子的調控下轉導帶有螢光酶基因之重組桿狀病毒。螢光酶活性分析的結果由上述西方墨點分析呈現。這代表在內源性drosha或dicer的表現被阻斷的情況下，經由桿狀病毒送入細胞內的轉殖基因表現是增加的，如第四圖。
    在一平行實驗(parallel experiment)中，一報導基因盒(reporter cassette)經由脂質體替代桿狀病毒轉導的方式送入標靶細胞。與桿狀病毒轉導相較，經由脂質體送入VeroE6細胞中，drosha抑制(drosha-knockdown)細胞的轉殖基因表現提升，而dicer抑制(dicer-knockdown)細胞之轉殖基因表現降低，如第五圖。在抑制drosha或dicer的U-2OS細胞中，對於經由脂質體轉殖的基因的表現並未有任何影響，亦如第五圖所示。這些結果顯示只有桿狀病毒轉導細胞的轉殖基因表現結果上升，且內源性RNAi路徑在桿狀病毒轉導入哺乳動物細胞的效率上為重要的。
    桿狀病毒AcMNPV通常不能成功感染家蠶BmN細胞。當家蠶BmN細胞內源性drosha或dicer之表現被沉默時，AcMNPV就可以成功進展到一病毒感染的非常晚期，可用非常晚期polyhedrin啟動子(也就是vAcpE)之活性證實，如第六A、B圖。西方墨點分析進一步證實這個發現，如第六C圖。事實上，當BmN細胞之drosha或dicer被抑制時，AcMNPV的三種啟動子被活化，如第七A、B圖。進一步分析顯示更多傳染性病毒粒子會造成BmN細胞的drosha或dicer沉默，顯示BmN細胞在drosha或dicer之表達被沉默時更容易受AcMNPV感染，如第八圖A、B。
    雖然桿狀病毒可以有效地轉染入多種哺乳動物細胞類型、特定細胞類型包括中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)、人類肺癌細胞(A549)，但顯示經由桿狀病毒轉染之基因很低或沒有表現。發現阻隔這些宿主細胞的防禦機制可增加桿狀病毒轉染的基因表現。為阻隔宿主的防禦機制，經由慢病毒(Lentivirus)轉染A549與CHO細胞系表現特定shRNAs。這些shRNAs設計來抑制包含在宿主防禦機制內不同宿主基因的功能，如表二。在A549細胞中，當一些宿主固有免疫基因如tlr2/3/9、ripk1與traf6被抑制的時候，桿狀病毒轉導效率與報導基因表現上升，如第九圖及第十一圖。在U-2OS細胞利用shRNAs拮抗這些基因，也有相似的結果，如第十圖及第十一圖。

    本發明說明書所揭露的技術特徵可以任何方式組合。本發明說明書所揭露的任一技術特徵可以替換成相同用途、等效用途或是相似用途的技術特徵。因此，除非特別說明，揭露的任一技術特徵僅為相等或相似技術特徵之中的一個例示。
    一本領域中具有通常知識者由上述說明可輕易了解本發明之技術特徵，在不脫離本發明之精神與範圍之情況下，可因不同用途與使用環境作不同改變與調整。因此，其他實施例亦包含於申請專利範圍中。
    第一圖係為利用RT-PCR試驗細胞轉染所標註的siRNA之RNAi效果圖。總RNA係從轉染所標註siRNA之細胞中萃取，且1 μg之總RNA作為cDNA合成的模板。U-2OS細胞內drosha及dicer(A)，VeroE6細胞(B)，以及BmN細胞(C)利用合成cDNA作為模版之標準PCR分析的表現程度。actin及gapdh的表現程度係作為內部控制(internal control)。
    第二圖係為U-2OS與VeroE6細胞轉染siRNA存活之長條圖。
    第三圖係為顯示轉導帶有綠色螢光蛋白(green fluorescence protein，GFP)基因的桿狀病毒之細胞之內源性drosha或dicer表現之抑制增加GFP表現的螢光影像與墨點影像。在轉導桿狀病毒之前，細胞轉染不同的siRNA。(A)轉導桿狀病毒之U-2OS細胞的螢光影像。(B)西方墨點分析顯示桿狀病毒轉導之U-2OS及VeroE6細胞的GFP表現。
    第四圖係為轉染不同的siRNA，再由帶有螢光酶基因之重組桿狀病毒轉導入U-2OS細胞以及VeroE6細胞之螢光酶分析長條圖。
    第五圖係為轉染不同的siRNA，再以lipofectamine 2000(Invitrogen)轉染劑轉染一帶有在CMVie啟動子控制螢光酶編碼序列質體之U-2OS細胞以及VeroE6細胞的螢光酶活性。
    第六圖係為抑制感染AcMNPV非常晚期之BmN細胞內內源性drosha或dicer表現之螢光影像及圖表。細胞轉染不同的siRNA，並感染一帶有非常晚期polyhedrin啟動子(vAcpE)控制的GFP基因之AcMNPV。(A)BmN細胞以drosha siRNA處理之螢光顯微鏡影像。(B)BmN細胞以dicer siRNA處理之螢光顯微鏡影像。(C)BmN細胞之西方墨點方析以及顯示GFP表現圖。
    第七圖為顯示BmN細胞內以(A)drosha或(B)dicer siRNA處理三類AcMNPV啟動子之活性增加的長條圖。
    第八圖係顯示BmN細胞先以(A)drosha siRNA或(B)dicer siRNA處理後有更多AcMNPV的後代產生。
    第九圖係為顯示抑制宿主抗病毒防禦相關基因，增強桿狀病毒轉導效率以及報導基因(GFP)在A549細胞之表現圖及螢光影像。A549細胞先經由慢病毒(Lentivirus)轉導入shRNA對準螢光酶基因(負控制組)、dicer(正控制組)、類鐸受體-2(toll-like receptor-2)、STAT1、介白素7R(interleukin 7R)、STAT6、或介白素1A(interleukin 1A)。接著該些細胞被一帶有GFP基因之桿狀病毒轉導。(A)轉導效率以GFP陽性細胞之百分比量測。(B)以GFP強度量測報導基因表現。(C)被桿狀病毒轉導的shRNA處理A549細胞之螢光影像。
    第十圖係為顯示U-2OS細胞中抑制宿主抗病毒防禦相關基因，會增強桿狀病毒報導子(GFP)的表現，但並未顯著增加轉導效率。U-2OS細胞先經由慢病毒轉導shRNA瞄準螢光酶(luciferase，負控制組)、dicer(正控制組)、類鐸受體-2(toll-like receptor-2)、TXNIP、STAT1、介白素7R(interleukin 7R)、以及STAT6。該些細胞接著被一帶有GFP基因之桿狀病毒轉導。(A)轉導效率以GFP陽性細胞之百分比量測。(B)以GFP強度量測報導基因表現。(C)被桿狀病毒轉導的shRNA處理U-2OS細胞之螢光影像。
    第十一圖係為顯示A549及U-2OS細胞中利用高通量篩選法找出抑制抗病毒相關基因，會增強桿狀病毒報導子(GFP)的表現。篩選方法為針對每一基因使用5種不同標定序列之shRNA，包括類鐸受體-2(toll-like receptor-2；a1~a5)、類鐸受體-3(toll-like receptor-3；b1~b5)、類鐸受體-4(toll-like receptor-4；c1~c5)、類鐸受體-9(toll-like receptor-9；d1~d5)、絲氨酸-蘇氨酸激酶受體激酶-1(receptor-interacting serine-threonine kinase 1；e1~e5)、絲氨酸-蘇氨酸激酶受體激酶-2(receptor-interacting serine-threonine kinase 2；f1~f5)、髓樣分化初級反應基因-88(myeloid differentiation primary response gene-88；g1~g5)、腫瘤壞死因子受體相關因子6(TNF receptor-associated factor 6；h1~h5)、TANK結合激酶1(TANK-binding kinase 1；i1~i5)、磷酸肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase；j1~j5)、第一型RNA聚合酶多肽D(RNA polymerase I polypeptide D，k1~k5)、以及螢光酶(luciferase，負控制組；l1)、TLR2(正控制組；l3)，經由慢病毒(Lentivirus)轉導進入細胞後表現shRNA抑制各基因表現後，再由帶有GFP基因之桿狀病毒進行轉導。(A)被桿狀病毒轉導的shRNA處理A549細胞之螢光影像。(B)被桿狀病毒轉導的shRNA處理U-2OS細胞之螢光影像。(C)篩選出各組中GFP螢光表現最強者，並以GFP強度量測比較報導基因於A549及U-2OS中的表現。
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    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 以tlr3為標靶之shRNA
    <400> 16

    <210> 17
    <211> 21
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 以tlr4為標靶之shRNA
    <400> 17

    <210> 18
    <211> 21
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 以tlr9為標靶之shRNA
    <400> 18

    <210> 19
    <211> 21
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 以ripk1為標靶之shRNA
    <400> 19

    <210> 20
    <211> 21
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 以ripk2為標靶之shRNA
    <400> 20

    <210> 21
    <211> 21
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 以nyd88為標靶之shRNA
    <400> 21

    <210> 22
    <211> 21
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 以traf6為標靶之shRNA
    <400> 22

    <210> 23
    <211> 21
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 以tbk1為標靶之shRNA
    <400> 23

    <210> 24
    <211> 21
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 以pik3cg為標靶之shRNA
    <400> 24

    <210> 25
    <211> 21
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 以polr1D為標靶之shRNA
    <400> 25
    权利要求:
    Claims (19)
    [1] 一種用於在一細胞內表現一基因之方法，包括：於一細胞內導入：(i)一抑制miRNA路徑與抗病毒防禦路徑之任一或二者的試劑；及(ii)一包含一核酸分子之桿狀病毒，且該核酸分子包括操作性連接至一啟動子之一基因；以及表現該基因於該細胞內。
    [2] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中與一缺少該抑制miRNA路徑之試劑的細胞之基因表現相較，該基因於該細胞內之表現是增加的。
    [3] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該試劑係抑制Drosha、Dicer、類鐸受體-2(Toll-like receptor-2)、STAT1、STAT6、介白素7R(interleukin 7R)、或介白素1A(Interleukin 1A)。
    [4] 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該試劑係抑制Drosha、Dicer、類鐸受體-2(Toll-like receptor-2)、STAT1、STAT6、介白素7R(interleukin 7R)、或介白素1A(Interleukin 1A)之表現。
    [5] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該試劑為一小抑制RNA(small inhibitory RNA,siRNA)。
    [6] 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該試劑係抑制Drosha或Dicer的表現。
    [7] 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該試劑為一siRNA。
    [8] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該細胞為一脊椎動物細胞。
    [9] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該細胞為一無脊椎動物細胞。
    [10] 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該細胞為一哺乳動物細胞。
    [11] 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該啟動子為一CMV啟動子。
    [12] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該桿狀病毒為一加州苜蓿夜蛾核多角體病毒(Autographa californica multicapsid nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)。
    [13] 一種製造桿狀病毒的方法，包含導入一桿狀病毒及一抑制miRNA路徑之試劑至一宿主細胞；以及複製該桿狀病毒於該宿主細胞內，藉此製造出該桿狀病毒的後代。
    [14] 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中當該宿主細胞中該抑制miRNA路徑之試劑不存在時，該桿狀病毒未複製。
    [15] 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該桿狀病毒為一加州苜蓿夜蛾核多角體病毒(AcMNPV)，且該宿主細胞為一BmN細胞。
    [16] 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該試劑係抑制Drosha、Dicer、類鐸受體-2(Toll-like receptor-2)、類鐸受體-3(Toll-like receptor-3)、類鐸受體-4(Toll-like receptor-4)、類鐸受體-9(Toll-like receptor-9)、STAT1、STAT6、介白素7R(interleukin 7R)、或介白素1A(Interleukin 1A)、絲氨酸-蘇氨酸激酶受體激酶-1(receptor-interacting serine-threonine kinase 1)、絲氨酸-蘇氨酸激酶受體激酶-2(receptor-interacting serine-threonine kinase2)、髓樣分化初級反應基因-88(myeloid differentiation primary response gene-88)、腫瘤壞死因子受體相關因子6(TNF receptor-associated factor 6)、TANK結合激酶1(TANK-binding kinase 1)、磷酸肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase)、第一型RNA聚合酶多肽D(RNA polymerase I polypeptide D)。
    [17] 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該試劑係抑制Drosha、Dicer、類鐸受體-2(Toll-like receptor-2)、類鐸受體-3(Toll-like receptor-3)、類鐸受體-4(Toll-like receptor-4)、類鐸受體-9(Toll-like receptor-9)、STAT1、STAT6、介白素7R(interleukin 7R)、或介白素1A(Interleukin 1A)、絲氨酸-蘇氨酸激酶受體激酶-1(receptor-interacting serine-threonine kinase 1)、絲氨酸-蘇氨酸激酶受體激酶-2(receptor-interacting serine-threonine kinase 2)、髓樣分化初級反應基因-88(myeloid differentiation primary response gene-88)、腫瘤壞死因子受體相關因子6(TNF receptor-associated factor 6)、TANK結合激酶1(TANK-binding kinase 1)、磷酸肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase)、第一型RNA聚合酶多肽D(RNA polymerase I polypeptide D)之表現。
    [18] 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該試劑為一siRNA。
    [19] 如申請專利範圍第18項所述之方法，其中該試劑係抑制Drosha或Dicer之表現。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    US8598136B2|2013-12-03|
    US20130109077A1|2013-05-02|
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    引用文献:
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